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注意事项:1.基础程序;2.扩增温度和延伸温度;3.反应时间;4.循环次数;5.PCR 反应液的配制;6.PCR技术的基本原理;7.PCR的反应动力学;8.PCR扩增产物;9.PCR反应体系与反应条件。
产品名称 | 猪丹毒杆菌PCR检测试剂盒规格 |
规格 | 50T |
货号 | LZP7896 |
组成及试剂配制:
1、酶标板:一块(96孔)
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/L,然后做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液:1×20ml。
4、 检测稀释液A:1×10ml。
5、 检测稀释液B:1×10ml。
实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
(1,1,3,四甲基丁基)酚(>93.0%(GC))CACYBP Antibody羧基酸
2,2-双(羟基)烷(>99.0%(GC))Phospho-CaMKII (Tyr231) Antibody2--(三氟甲基)酸
2,2-双()-1,1-二烷(>98.0%(GC))CaMKII-α Antibody苄基酮
2,2-双()-1,1-二(>99.0%(GC))PI3 Kinase Class III (D4E2) Rabbit mAb6-溴己酸酯
2,二酚(>98.0%(GC))PI3 Kinase Class III (D4E2) Rabbit mAb三氟甲酸甲酯
2,二酚(>98.0%(GC))ATF-3 (D2Y5W) Rabbit mAb溴
1,2-二溴-烷(1mg/mL的甲溶液)Phospho-TORC1/CRTC1 (Ser151) Antibody氟硫酚
邻二甲酸丁苄酯(>97.0%(GC))RagC Antibody2-氨基-2-基丁酸
邻二甲酸二戊酯(>98.0%(GC))CaMKII (pan) Antibody聚磺酸钠
邻二甲酸二丁酯(>97.0%(GC))Sox9 (D8G8H) Rabbit mAb (Biotinylad)甲氨基盐酸盐
邻二甲酸二环己酯(>99.0%(GC))Dicer Antibody氨基-2,6-二吡啶
邻二甲酸二酯(>98.0%(GC))Dicer Antibody2-(N-Boc-哌啶基)
邻二甲酸双(2-基己基)酯(>98.0%(GC))Drosha (D28B1) Rabbit mAbBoc-L-苏氨酸
邻二甲酸二酯(>98.0%(GC))Drosha (D28B1) Rabbit mAb(R)-2-氨甲基-1-N-Boc-吡咯烷
邻二甲酸二己酯(>98.0%(GC))CaMKI-δ Antibody10-氮(杂)蒽
三丁基化锡(>97.0%(T))Neuropilin-2 (D39A5) XP® Rabbit mAb-2-氟酚
3,并芘(升华精制品)(>95.0%(GC))Neuropilin-2 (D39A5) XP® Rabbit mAb-氟酚
双(酰)二硫化物(>98.0%(HPLC))GST (26H1) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)2-甲基-6-三氟甲基吡啶-羧酸
角化细胞生长因子(KGF)ELISA试剂盒PN/MMAC1(CT) 一种肿瘤抑制基因(C端)20 ul
角化细胞内分泌因子(KAF)/双调蛋白(AR)ELISA试剂盒Phospho-PN (Ser380) 酸化肿瘤抑制基因PN100 ul
胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)ELISA试剂盒Phospho-PN (Ser380/Thr382/Thr383) 酸化肿瘤抑制基因PN100 ul
胶原吡啶交联(PYD)ELISA试剂盒PGE2 E220 ul
胶原C末端肽(CTX)ELISA试剂盒PTGEs E合成酶100 ul
降钙素原(PCT)ELISA试剂盒PTHrP/PTHLH 甲状旁腺激素相关蛋白500µl
降钙素基因相关肽(CGRP)ELISA试剂盒PTN 多效生长因子100 ul
降钙素(CT)ELISA试剂盒PTP/PTPase/CD148 蛋白酪氨酸酸酶CD148100 ul
性酸酶(ALP)ELISA试剂盒PTP-1B 蛋白酪氨酸酸酶-1B100 ul
猪丹毒杆菌PCR检测试剂盒规格唇裂和腭裂相关跨膜蛋白1抗体Bisisorhapontigenin A中文名:别名:分子式:C30H26O8
趋化素样因子超家族成员8抗体Gnetifolin A中文名:别名:分子式:C16H14O6
趋化素样因子超家族成员1抗体Isocalophyllic acid中文名:别名:分子式:C25H24O6
神经细胞蜡样质脂褐质沉积病蛋白CLN6抗体Calophyllic acid中文名:别名:分子式:C25H24O6
神经细胞蜡样质脂褐质沉积病蛋白CLN3抗体(3S,5S)-[4]-Gingerdiol中文名:别名:分子式:C15H24O4
检测步骤:
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
(1) 计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液,向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM。淬灭基团:NONE,请勿选择ROX参比荧光。