RT-PCR试剂盒合适的温度通常在45-68℃之间(预备实验可2℃间隔进行)。另外,由于在60-68℃间,也有很高的活性,因此可在此温度范围内设定温度,进行2 Step PCR。
RT-PCR试剂盒是为两步法RT-PCR一步实验配制的,具有高灵敏度的RT-PCR反应系统,可以从极低量的总RNA或poly(A)+RNA合成一链cDNA。与PCR反应相结合,可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。合理配备与cDNA一链合成反应相关的各种组分,该试剂盒有高效的逆转录酶活性,对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好,适合于各种PCR耐热聚合酶。
RT-PCR试剂盒试验时进行的PCR反应:
1.吸取10%的一链反应液(2μl)进行PCR反应;即使加入更多量的一链反应液也不能增加其扩增的产物量,反而可能会抑制正常的PCR反应;
2.94℃加热变性2min;
3.设置15-40个PCR循环。退火与延伸条件依引物和模板而定。
相关注意事项:
1.用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。
2.RNA样品要避免基因组DNA污染。
3.避免多次反复冻融RNA,使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4.试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5.cDNA产物应置于-20℃保存。