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注意事项:1.基础程序;2.扩增温度和延伸温度;3.反应时间;4.循环次数;5.PCR 反应液的配制;6.PCR技术的基本原理;7.PCR的反应动力学;8.PCR扩增产物;9.PCR反应体系与反应条件。
产品名称 | 耐万古霉素肠球菌PCR检测试剂盒规格 |
英文名称 | VancomycinResistant Enterococcus(VRE)PCR |
货号 | LZP7444 |
实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。检测步骤:
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振荡混匀后,10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
(1) 计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液,向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团:设置为FAM。淬灭基团:NONE,请勿选择ROX参比荧光。
组成及试剂配制:
1、酶标板:一块(96孔)
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/L,然后做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液:1×20ml。
4、 检测稀释液A:1×10ml。
5、 检测稀释液B:1×10ml。
CNP-AfuBOC-L-色氨酸 98%胺苯磺隆 分析标准品,95%
Potassium sorbateN-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酸 97%线磷 分析标准品,96%
Calcium DL-malateN-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酸 99%标准溶液100μg/ml,u=3%,溶剂:酮
MU-Gal[Hyp<sup>3</sup>]Bradykinin ≥97% (HPLC)标准溶液100μg/ml,u=5%,溶剂:酮
MU-α-GalBOC-L-天冬酰胺 BR异标准溶液 100μg/ml,u=3%()
MUDO-叔丁基-L-苏氨酸甲酯盐酸盐 98%异标准溶液 10μg/ml,u=5%()
1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-β-D-ribofurase1-苄基D-谷氨酸酯 98%a-硫丹标准溶液 100μg/ml,u=3%,基体:苯
D-Glucuronic acidBoc-L-氨酸 N-丁二酰亚胺酯 BRa-硫丹标准溶液 10μg/ml,u=5%
Sodium D-glucuronate(R)-N-叔丁氧羰基-3-代氨酸甲酯 BRβ-硫丹标准溶液 100μg/ml,u=3%
D-GlucuroneBOC-D-精氨酸盐酸盐 BRβ-硫丹标准溶液 10μg/ml,u=5%
SteviosideBoc-Arg(Mts)-OH·CHA BR硫丹 分析标准品,98%()
Calcium PyruvateBOC-硝基-L-精氨酸 99%标准溶液 100μg/ml,u=2%()
Magnesium L-lactate hydrateN-叔丁氧羰基-N'-甲苯磺酰基-L-精氨酸 B标准溶液 10μg/ml,u=3%()
Potassium L-lactateBOC-对磺酰-D-精氨酸 98%酮中乙嘧硫磷标准溶液 100μg/ml,u=2%
Zinc citrate叔丁氧羰基-N-beta-三苯甲基-L-天门冬酰胺 98%酮中乙嘧硫磷标准溶液 10μg/ml,u=2%
Iron(II) D-gluconate dihydrateBOC-L-天门冬酰胺 4-酯 98%烯炔菊酯 分析标准品,97%
乙(工业级)Pim-1 (C93F2) Rabbit mAbMRP9/ABCC12 多药耐药相关蛋白9抗体
异辛烷(ACS,≥99.0%)Pim-1 (C93F2) Rabbit mAbMRP8+MRP14 多药耐药相关蛋白8/9/14抗体
乙(ACS, ≥99.5%)PKG-1 (C8A4) Rabbit mAbMRP8/ABCC11 多药耐药相关蛋白8抗体
2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙(99%)Mic-1 (Y60) AntibodyMRP7/ABCC10 多药耐药相关蛋白7抗体
1,2-苯二乙()HER2/ErbB2 (M45) AntibodyMRP5/ABCC5 多药耐药相关蛋白5抗体
2-溴-1,3,5-三异基苯(96.0 %)TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)MRP4/ABCC4 多药耐药相关蛋白4抗体
2,2'-双(三氟甲基)二氨基联苯(98.0%)Phospho-Caveolin-1 (Tyr14) AntibodyMRP3 多药耐药相关蛋白3抗体
1,3-二咔唑-9-基苯(98%)Phospho-Caveolin-1 (Tyr14) AntibodyMRP2 多药耐药相关蛋白2抗体
苯(AR,≥99.5%)p53 (D2H9O) Rabbit mAb (Rodent Specific)MRP1/ABCC1 多药耐药相关蛋白1抗体
苯(CP,≥99%)Flotillin-1 AntibodyMRGX1/MRGPRC/SNSR G蛋白偶联受体MRGX1抗体
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